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DNA与PCR实验室核酸检测原理及实验方法

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摘要：

DNA与PCR实验室核酸检测原理及实验方法

一、目的

(1)掌握真核生物细胞基因组RNA制备和定量的基本方法。

(2)掌握反转录PCR实验室的原理及实验方法。

二、原理

获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验。由于细胞内大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在,所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离,得到纯化的总RNA。

通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA,其中大部分为rRNA及tRNA，而mR-NA仅占1%~5%。在基因表达过程中，mRNA作为蛋白质翻译合成的模板,编码了细胞内所有的多肽和蛋白质，因此,mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。mRNA分子种类繁多，分子大小不均一,但在多数真核细胞mRNA的3’末端都带有一段较长的多聚腺苷酸链(polyA),可以从总RNA中用寡聚(dT)亲和层析等方法分离出mRNA.

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是利用两已知序列的寡核苷酸作为上、下游引物在耐热性DNA聚合(Cxg)作用下将位于楼板DNA上两引物间特定的DVA段进行一种指数级增长的复制过程。

PCR反应体系由模板DNA、引物耐热性DNA聚合酶、底物(4种dNTP)、缓冲液和Mg\"等组成。其操作过程为变性、退火、延伸s个步骤循环这行其中变性是加热条件下模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使棋板DNA与高浓度引物间的互补结合,延伸是在耐热性DNA聚合酶和Mg2+等存在下扩增特定的DNA片段。每次循环的扩增产物又可作为下一循环的模板,因此，理论上每经过一轮变性、退火、延伸3个步骤,特定DNA片段的分子数目就增加一倍。耐热性DNA聚合酶的应用使PCR循环反应可自动进行,提高了反应的特异性和效率。引物设计是PCR技术的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种PCR技术，现在利用计算机软件可辅助设计某-已知序列基因的特定引物。

PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在医学、分子生物学领域得到了广泛应用，如应用于DNA克隆、突变分析、基因融合、基因半定量、遗传性疾病的诊断等方面。PCR技术还可与其他分子生物学技术相结合发展产生新的技术，如反转录PCR(RT PCR)、反向PCR(IPCR)、不对称PCR等,使PCR在科研及临床上的应用得到了更大发展。

反转承everse rasrptin)也称为逆转录，是依赖RNA的DNA合成作用，以RNA为模饭,由dNTP聚合成DNA分子。反应过程先以单链RNA的基因组为模板，催化合成-条单链DNA.产物与模板生成RNA与DNA杂化双链,杂化双链中的RNA被RNA醉水解后，再以新合成的单链DNA为模板，催化合成第二链的DNA.催化此反应的酶称为逆转录酶，也称反转录酶。

反转录-聚合酶链反应(reverse transcription - polymerase chain reaction, RT - PCR)是PCR技术的一种广泛应用的形式,原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT- PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

本实验通过提取培养动物细胞的总RNA,以反转录酶进行反转录反应获得cDNA,作为PCR的模板扩增3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因中一段300bp的DNA片段，两个引物的5'末端分别引人EcoR1和BamHI的酶切位点,为DNA重组实验做准备。

三、实验材料、器材和试剂

1.实验材料

培养动物细胞;动物组织。

2.实验器材

①PCR仪;②锡海超净工作台;③离心管;④移液器;⑤移液枪头;⑥冰盒;⑦离心机;⑧匀浆器;⑨紫外可见分光光度计。

3.实验试剂

①Trizol;②异丙醇;③氯仿;④70%乙醇;⑤反转录酶;⑥10mM dNTPs;⑦反转录5XPCR buffer;⑧Oligo( dT)或随机引物;⑨RNaseA抑制剂;①10X Taq DNA酶缓冲液;①TaqDNA聚合酶(5U/pL);②DEPC水:100mL双蒸水中加人,充分振荡,37C孵育过夜，15磅(1磅=0.45kg)高压灭菌,4C下保存备用;3对应目的基因的特异上下游引物;④0. 5mg/ mL溴化乙绽(EB) ;?5X TBE(pH值为8.3电泳缓冲液):Tris5.4g、硼酸2.25g、EDTA 0.46g、双蒸水定容至100mL;⑥6X上样缓冲液:0.25 %溴盼蓝、0. 25%二甲苯青,40%(W/V)蔗糖水溶液;⑦琼脂糖;DNAmarker.

文章来源：《分析试验室》网址: http://www.fxsys.cn/zonghexinwen/2020/1010/499.html